Зимография: особенности постановки метода визуализации активности ферментов в почвах

Ферменты, продуцируемые почвенной биотой, являются ключевым звеном в регуляции биохимических процессов. Активность ферментов в почве может быть визуализирована с помощью зимографии – метода, основанного на применении флуоресцирующих субстратов и позволяющего получать двумерные изображения (зимограммы). Авторами предложен вариант зимографической установки, представлены параметры освещения, фотоаппаратуры и режимов съемки, подготовка реактивов и калибровка. На примере контрастных по гранулометрическому составу почв (песок и тяжелый суглинок) детально описаны процессы подготовки образцов к анализу и сам анализ. Рассмотрены различные варианты внесения субстрата: раскапывание, окунание, насыщение, также проведена оценка влияния длительности инкубирования образцов на качество получаемых изображений. Оценены возможности и недостатки метода, предложены варианты решения методических проблем, возникающих в процессе анализа. Зимография – перспективный метод, позволяющий сопоставить данные с результатами других методов. Использование нейросетевых технологий позволяет с высокой достоверностью получить объемное распределение почвенных ферментов. Зимография требует качественно проделанной подготовительной работы и предельной аккуратности при проведении анализа. Необходимо обеспечить максимальный контакт между субстратом и почвой, так как это один из ключевых факторов, определяющих качество результатов. Установлено, что наиболее оптимальным способом внесения субстрата является насыщение мембран в растворе на протяжении 60 минут. На данном этапе развития метода нет возможности установить универсальное время инкубирования образцов, так как оно зависит от ряда характеристик как исследуемой почвы, так и условий проведения зимографии. При презентации результатов метода необходимо детально документировать условия его проведения.

1. Даденко Е.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И., Вальков В.Ф. Изменение ферментативной активности при хранении почвенных образцов // Почвоведение. 2009. № 12. С. 1481–1486.

2. Девятова Т.А. Ферментативная активность чернозема выщелоченного при длительном систематическом применении удобрений // Агрохимия. 2006. № 1. С 12–15.

3. Ефремова Т.Т., Овчинникова Т.М. Сезонная оксиредуктазная активность осушенных торфяных почв в связи с гидротермическими условиями среды // Сибирский экологический журнал. 2008. Т. 15. № 3. С. 441–449.

4. Инишева Л.И., Ивлева С.Н., Щербакова Т.А. Руководство по определению ферментативной активности торфяных почв и торфов. Т.: Национальный исследовательский Томский государственный университет, 2003. 119 с.

5. Каширская Н.Н., Плеханова Л Н., Чернышева Е.В., Ельцов М.В., Удальцов С.Н., Борисов А.В. Пространственно-временные особенности фосфатазной активности естественных и антропогенно-преобразованных почв // Почвоведение. 2020. № 1. С. 89–101. DOI: 10.1134/S0032180X20010098.

6. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 1990. 192 с.

7. Alkorta I., Aizpurua A., Riga P., Albizu I., Amézaga I., Garbisu C. Soil enzyme activities as biological indicators of soil health // Rev. Environ. Health. 2003. Vol. 18. No. 1. P. 65–73. DOI: 10.1515/REVEH.2003.18.1.65.

8. Baldrian P., Větrovský T. Scaling down the analysis of environmental processes: Monitoring enzyme activity in natural substrates on a millimeter resolution scale // Appl. Environ. Microbiol. 2012. Vol. 78. No. 9. P. 3473–3475. DOI: 10.1128/AEM.07953-11.

9. Bilyera N., Kuzyakova I., Guber A., Razavi B.S., Kuzyakov Y. How “hot” are hotspots: Statistically localizing the high-activity areas on soil and rhizosphere images // Rhizosphere. 2020. Vol. 16. P. 100259. DOI: 10.1016/j.rhisph.2020.100259.

10. Bilyera N., Zhang X., Duddek P., Fan L., Banfield C.C., Schlüter S., Carminati A., Kaestner A., Ahmed M.A., Kuzyakov Y., Dippold M.A., Spielvogel S., Razavi B.S. Maize genotype-specific exudation strategies: an adaptive mechanism to increase microbial activity in the rhizosphere // Soil Biol. Biochem. 2021. Vol. 162. P. 108426. DOI: 10.1016/j.soilbio.2021.108426.

11. Burns R.G. Soil enzymology // Sci. Prog. 1977. Vol. 64. No. 254. P. 275–285. URL: https://www.jstor.org/stable/43420415.

12. Burns R.G., DeForest J.L., Marxsen J., Sinsabaugh R.L., Stromberger M.E., Wallenstein M.D., Weintraub M.N., Zoppini A. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions // Soil Biol. Biochem. 2013. Vol. 58. P. 216–234. DOI: 10.1016/j.soilbio.2012.11.009.

13. Cao T., Kong X., He W., Chen Y., Fang Y., Li Q., Chen Q., Luo Y., Tian X. Spatiotemporal characteristics of enzymatic hotspots in subtropical forests: In situ evidence from 2D zymography images // Catena. 2022. Vol. 216. P. 106365. DOI: 10.1016/j.catena.2022.106365.

14. Dong S., Brooks D., Jones M.D., Grayston S.J. A method for linking in situ activities of hydrolytic enzymes to associated organisms in forest soils // Soil Biol. Biochem. 2007. Vol. 39. No. 9. P. 2414–2419. DOI: 10.1016/j.soilbio.2007.03.030.

15. Duan C., Fang L., Yang C., Chen W., Cui Y., Li S. Reveal the response of enzyme activities to heavy metals through in situ zymography // Ecotoxicol. Environ. Saf. Safety. 2018. Vol. 156. P. 106–115. DOI: 10.1016/j.ecoenv.2018.03.015.

16. Ge T., Wei X., Razavi B.S., Zhu Z., Hu Y., Kuzyakov Y., Jones D.L., Wu J. Stability and dynamics of enzyme activity patterns in the rice rhizosphere: effects of plant growth and temperature // Soil Biol. Biochem. 2017. Vol. 113. P. 108–115. DOI: 10.1016/j.soilbio.2017.06.005 .

17. Gianfreda L., Bollag J.M. Effect of soils on the behavior of immobilized enzymes // SSSA Journal. 1994. Vol. 58. No. 6. P. 1672–1681. DOI: 10.2136/sssaj1994.03615995005800060014x.

18. Giles C.D., Dupuy L., Boitt G., Brown L.K., Condron L.M., Darch T., Blackwell M.S.A., Menezes-Blackburn D., Shand C.A., Stutter M.I., Lumsdon D.G., Wendler R., Cooper P., Wearing C., Zhang H., Haygarth P.M., Georgea T.S. Root development impacts on the distribution of phosphatase activity: improvements in quantification using soil zymography // Soil Biol. Biochem. 2018. Vol. 116. P. 158–166. DOI: 10.1016/j.soilbio.2017.08.011.

19. Gramms G., Voigt K.D., Kirsche B. Oxidoreductase enzymes liberated by plant roots and their effects on soil humic material // Chemosphere. 1999. Vol. 38. P. 1481–1494. DOI: 10.1016/S0045-6535(98)00369-5.

20. Guber A., Kravchenko A., Razavi B.S., Uteau D., Peth S., Blagodatskaya E., Kuzyakov Y. Quantitative soil zymography: mechanisms, processes of substrate and enzyme diffusion in porous media // Soil Biol. Biochem. 2018. Vol. 127. P. 156–167. DOI: 10.1016/j.soilbio.2018.09.030.

21. Guber A., Kravchenko A., Razavi B.S., Blagodatskaya E., Kuzyakov Y. Calibration of 2‐D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution // Eur. J. Soil Sci. 2019. Vol. 70. No. 4. P. 715–726. DOI: 10.1111/ejss.12744.

22. Guber A., Blagodatskaya E., Juyal A., Razavi B.S., Kuzyakov Y., Kravchenko A. Time-lapse approach to correct deficiencies of 2D soil zymography // Soil Biol. Biochem. 2021. Vol. 157. P. 108225. DOI: 10.1016/j.soilbio.2021.108225.

23. Hapca S., Baveye P. C., Wilson C., Lark R. M., Otten W. Three-dimensional mapping of soil chemical characteristics at micrometric scale by combining 2D SEM-EDX data and 3D X-Ray CT images // Plos one. 2015. Vol. 10. No. 9. P. e0137205. DOI: 10.1371/journal.pone.0137205 .

24. Heitkötter J., Marschner B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biol. Biochem. 2018. Vol. 124. P. 210–217. DOI: 10.1016/j.soilbio.2018.06.021.

25. Hoang D.T.T., Razavi B.S., Kuzyakov Y., Blagodatskaya E. Earthworm burrows: kinetics and spatial distribution of enzymes of C-, N-and P-cycles // Soil Biol.Biochem. 2016. Vol. 99. P. 94–103. DOI: 10.1016/j.soilbio.2016.04.021.

26. Khosrozadeh S., Guber A., Kravchenko A., Ghaderi N., Blagodatskaya E. Soil oxidoreductase zymography: Visualizing spatial distributions of peroxidase and phenol oxidase activities at the root-soil interface // Soil Biol. Biochem. 2022. Vol. 167. P. 108610. DOI: 10.1016/j.soilbio.2022.108610.

27. Kravchenko A., Guber A., Razavi B.S., Koestel J., Blagodatskaya E., Kuzyakov Y. Spatial patterns of extracellular enzymes: combining X-ray computed micro-tomography and 2D zymography // Soil Biol. Biochem. 2019a. Vol. 135. P. 411–419. DOI: 10.1016/j.soilbio.2019.06.002.

28. Kravchenko A.N., Guber A.K., Razavi B.S., Koestel J., Quigley M.Y., Robertson G.P., Kuzyakov Y. Microbial spatial footprint as a driver of soil carbon stabilization // Nat. Commun. 2019b. Vol. 10. No. 1. P. 1–10. DOI: 10.1038/s41467-019-11057-4.

29. Kravchenko A., Guber A., Gunina A., Dippold M., Kuzyakov Y. Pore‐scale view of microbial turnover: Combining 14C imaging, μCT and zymography after adding soluble carbon to soil pores of specific sizes // Eur. J. Soil Sci. 2021. Vol. 72. No. 2. P. 593–607. DOI: 10.1111/ejss.13001.

30. Kuzyakov Y., Blagodatskaya E. Microbial hotspots and hot moments in soil: Concept and review // Soil Biol. Biochem. 2015. Vol. 83. P. 184–199. DOI: 10.1016/j.soilbio.2015.01.025.

31. Ma X., Razavi B.S., Holz M., Blagodatskaya E., Kuzyakov Y. Warming increases hotspot areas of enzyme activity and shortens the duration of hot moments in the root-detritusphere // Soil Biol. Biochem. 2017. Vol. 107. P. 226–233. DOI: 10.1016/j.soilbio.2017.01.009 .

32. Pinton R., Varanini Z., Nannipieri P. The rhizosphere as a site of biochemical interactions among soil components, plants, and microorganisms // The rhizosphere. CRC Press, 2000. P. 17–34.

33. Rao M.A., Violante A., Gianfreda L. Interaction of acid phosphatase with clays, organic molecules and organo-mineral complexes: kinetics and stability // Soil Biol. Biochem. 2000. Vol. 32. P. 1007–1014.

34. Razavi B.S., Zarebanadkouki M., Blagodatskaya E., Kuzyakov Y. Rhizosphere shape of lentil and maize: spatial distribution of enzyme activities // Soil Biol. Biochem. 2016. Vol. 96. P. 229–237. DOI: 10.1016/j.soilbio.2016.02.020.

35. Razavi B.S., Zhang X., Bilyera N., Guber A., Zarebanadkouki M. Soil zymography: simple and reliable? Review of current knowledge and optimization of the method // Rhizosphere. 2019. Vol. 11. P. 100161. DOI: 10.1016/j.rhisph.2019.100161.

36. Razavi B.S., Hoang D., Kuzyakov Y. Visualization of enzyme activities in earthworm biopores by in situ soil zymography // Methods in Molecular Biology. Zymography. N.Y.: Humana Press, 2017. P. 229–238. DOI: 10.1007/978-1-4939-7111-4.

37. Sanaullah M., Razavi B.S., Blagodatskaya E., Kuzyakov Y. Spatial distribution and catalytic mechanisms of β-glucosidase activity at the root-soil interface // Biol. Fertil. Soils. 2016. Vol. 52. P. 505–514. DOI: 10.1007/s00374-016-1094-8.

38. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T., Preibisch S., Rueden С., Saalfeld S., Schmid B., Tinevez J.-Y., White D.J., Hartenstein V., Eliceiri K., Tomancak P., Cardola A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis // Nature methods. 2012. Vol. 9. No. 7. P. 676–682. DOI: 10.1038/nmeth.2019.

39. Schofield E.J., Brooker R.W., Rowntree J.K., Price E.A.C., Brearley F.Q., Paterson E. Plant-plant competition influences temporal dynamism of soil microbial enzyme activity // Soil Biol. Biochem. 2019. Vol. 139. P. 107615. DOI: 10.1016/j.soilbio.2019.107615.

40. Spohn M., Kuzyakov Y. Distribution of microbial-and root-derived phosphatase activities in the rhizosphere depending on P availability and C allocation – Coupling soil zymography with 14C imaging // Soil Biol. Biochem. 2013. Vol. 67. P. 106–113. DOI: 10.1016/j.soilbio.2013.08.015.

41. Spohn M., Carminati A., Kuzyakov Y. Soil zymography – a novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil // Soil Biol. Biochem. 2013. Vol. 58. P. 275–280. DOI: 10.1016/j.soilbio.2012.12.004.

42. Spohn M., Kuzyakov Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity as affected by living and dead roots – a soil zymography analysis// Plant Soil. 2014. Vol. 379. P. 67–77. DOI: 10.1007/s11104-014-2041-9.

43. Steinweg J.M., Dukes J.S., Paul E.A., Wallenstein M.D. Microbial responses to multi-factor climate change: effects on soil enzymes // Front. Microbiol. 2013. Vol. 4. P. 146. DOI: 10.3389/fmicb.2013.00146 .

44. Tabatabai M.A., Dick W.A. Enzymes in soil: research and developments in measuring activities // Enzymes in the environment: Activity, ecology, and applications. N.Y.: Marcel Dekker, 2002. P. 567–596.

45. Wallenstein M.D., Weintraub M.N. Emerging tools for measuring and modeling the in-situ activity of soil extracellular enzymes // Soil Biol. Biochem. 2008. Vol. 40. No. 9. P. 2098–2106. DOI: 10.1016/j.soilbio.2008.01.024.